真核細(xì)胞DNA提取試劑盒的制備與定量

   制備基因組 DNA 是進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)和功能研究的重要步驟，通常要求得到的片段長(zhǎng)度不小于 100-200kb。在 DNA 提取過程中應(yīng)盡量避免使 DNA 斷裂和降解的各種因素，以保證 DNA 的完整性，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。
      一般真核細(xì)胞基因組 DNA 有 10???bp，可從新鮮組織、培養(yǎng)細(xì)胞或低溫保存的組織細(xì)胞中提取，常采用在 EDTA 及 SDS 等試劑存在下用蛋白酶 K 消化細(xì)胞，隨后用酚抽提的方法。通過該方法獲得的 DNA 經(jīng)酶切后可用于 Southern 分析，也可作為 PCR 的模板、用于文庫構(gòu)建等實(shí)驗(yàn)。

根據(jù)材料來源不同，需采取不同的材料處理方法，而后的DNA 提取方法大體類似，但都應(yīng)考慮以下兩個(gè)原則：

防止和抑制DNase 對(duì) DNA 的降解；

盡量減少對(duì)溶液中DNA 的機(jī)械剪切破壞。

一、試劑準(zhǔn)備

TE：10mM Tris-HCl (pH 7.8)；1mM EDTA (pH 8.0)

TBS：25mM Tris-HCl (pH 7.4)；200mM NaCl；5mM KCl

裂解緩沖液：250mM SDS；使用前加入蛋白酶 K 至 100μg/ml

20% SDS

2mg/ml 蛋白酶 K

Tris 飽和酚（pH 8.0）、酚 / 氯仿（酚∶氯仿 = 1∶1）、氯仿

無水乙醇、75% 乙醇

二、操作步驟

（一）材料處理

新鮮或冰凍組織處理：

⑴ 取組織塊 0.3-0.5cm3，剪碎，加 TE 0.5ml，轉(zhuǎn)移到勻漿器中勻漿；

⑵ 將勻漿液轉(zhuǎn)移到 1.5ml 離心管中；

⑶ 加 20% SDS 25μl，蛋白酶 K (2mg/ml) 25μl，混勻；

⑷ 60°C 水浴 1-3hr。

培養(yǎng)細(xì)胞處理：

⑴ 將培養(yǎng)細(xì)胞懸浮后，用 TBS 洗滌一次；

⑵ 離心 4000g×5min，去除上清液；

⑶ 加 10 倍體積的裂解緩沖液；

⑷ 50-55°C 水浴 1-2hr。

（二）DNA 提取

加等體積飽和酚至上述樣品處理液中，溫和、充分混勻3min；

離心5000g×10min，取上層水相到另一 1.5ml 離心管中；

加等體積飽和酚，混勻，離心5000g×10min，取上層水相到另一管中；

加等體積酚/ 氯仿，輕輕混勻，離心 5000g×10min，取上層水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重復(fù)此步驟數(shù)次；

加等體積氯仿，輕輕混勻，離心5000g×10min，取上層水相到另一管中；

加1/10 體積的 3M 醋酸鈉（pH 5.2）和 2.5 倍體積的無水乙醇，輕輕倒置混勻；

待絮狀物出現(xiàn)后，離心5000g×5min，棄上清液；

沉淀用75% 乙醇洗滌，離心 5000g×3min，棄上清液；

室溫下?lián)]發(fā)乙醇，待沉淀將近透明后加50-100μl TE 溶解過夜。

（三）DNA 定量和電泳檢測(cè)

DNA 定量：

DNA 在 260nm 處有最大吸收峰，蛋白質(zhì)在 280nm 處有最大吸收峰，鹽和小分子則集中在 230nm 處。因此，可用 260nm 波長(zhǎng)分光測(cè)定 DNA 濃度，OD 值為 1 相當(dāng)于大約 50μg/ml 雙鏈 DNA。

若用1cm 光徑，用 H?O 稀釋 DNA 樣品 n 倍并以 H?O 為空白對(duì)照，根據(jù)讀出的 OD???值可計(jì)算樣品稀釋前的濃度：

DNA（mg/ml）=50×OD???讀數(shù) × 稀釋倍數(shù) / 1000

DNA 純品的 OD???/OD???為 1.8，可根據(jù)該比值估計(jì) DNA 純度：比值較高說明含有 RNA，比值較低說明有殘余蛋白質(zhì)存在。

OD???/OD???的比值應(yīng)在 0.4-0.5 之間，若比值較高說明有殘余的鹽存在。

電泳檢測(cè)：

取1μg 基因組 DNA 在 0.8% 瓊脂糖凝膠上電泳，檢測(cè) DNA 的完整性或多個(gè)樣品的濃度是否相同。電泳結(jié)束后在點(diǎn)樣孔附近應(yīng)有單一的高分子量條帶。

三、注意事項(xiàng)

所有用品均需要高溫高壓處理，以滅活殘余的DNA 酶；

所有試劑均用高壓滅菌雙蒸水配制；

用大口滴管或吸頭操作，以盡量減少打斷DNA 的可能性；

用上述方法提取的DNA 純度可滿足一般實(shí)驗(yàn)（如 Southern 雜交、PCR 等）需求。如要求更高純度，可進(jìn)入蘇州阿爾法生物實(shí)驗(yàn)器材有限公司? 官網(wǎng)參考有關(guān)資料進(jìn)行DNA 純化。